荧光激活微液滴分选（FADS）技术助力新酶资源挖掘
—— 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所医药酶工程研究中心创新团队
酶是高效、高选择性、绿色环保的生物催化剂，在化工、诊断、医药、环保、食品、能源、农业、畜牧、纺织等社会生活的各个领域都发挥着重要作用。工业应用场景往往要求酶在高温、极端pH、非天然底物等苛刻条件下进行工作，然而大多数天然酶的工作环境仅限于温和的生理条件，因而在应用中往往存在催化效率低、稳定性差等问题。定向进化技术是在实验室中模拟自然界达尔文进化的原理，可以在短短几个月时间完成自然界亿万年才实现的酶分子进化，极大提升了人类自主改造天然酶的能力，彻底改变了人类社会用酶“靠天吃饭”的困境，极大推动了酶工程领域的进步，因而该技术的发明人美国Frances H. Arnold教授获得2018年诺贝尔化学奖。
定向进化在实验室中人工构建目标酶的基因突变文库，再通过施加选择压力对突变库进行功能筛选，从庞大的突变库中筛选极少数符合预期性能的阳性突变体——通过迭代的突变-筛选，逐步提升目标酶的性能，最终满足应用场景的需求。由于基因突变库的库容量通常十分巨大（106以上），而其中阳性突变体的比例极低，因此定向进化的成功很大程度上依赖于人们对突变库的筛选能力。不幸的是，长期以来酶突变库筛选的方法受限于传统的微孔板筛选法、高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法等，筛选通量在102-103个突变体每天，相比于庞大的突变库可以说是大海捞针。传统筛选方法筛选通量低、工作量大，导致新酶研发的效率低，难以满足日益增长的酶工程应用的需求。因此亟待从筛选方法学进行突破，研制高通量乃至超高通量的筛选方法。
基于液滴微流控技术的荧光激活微液滴超高通量筛选（fluorescence-activated droplet sorting，FADS）技术，从方法学上为酶大容量突变库的筛选提供了强有力的解决方案。FADS技术的核心是利用大小均一的微流控液滴将酶筛选体系从宏观尺度（微升/毫升级）微缩到单细胞尺度（皮升级），再利用微流控芯片的快速检测及分选功能实现单细胞酶微反应器的超高通量筛选，筛选通量高达每天1000万个突变体，相比于传统的筛选方法提升1万倍以上，而筛选的试剂消耗则降低了100万倍以上，大大提升了人们对突变库的筛选能力。因此该技术自2009年问世以来便得到了人们的广泛关注。
图1. 基于液滴微流控的单细胞微反应器超高通量酶筛选技术原理
1、十年磨一剑——打造液滴微流控超高通量筛选技术高地
2009年，马富强投入酶学泰斗冯雁教授门下进行研究生学习，凭借在酶工程领域数十年的学科造诣和敏锐的技术洞察力，两位导师冯雁老师和杨广宇老师在当时就重点发展单细胞微反应器超高通量筛选技术，在两位导师的精心指导和鼓励下，他逐步攻克了微流控芯片制备、微液滴生成、单细胞微反应器构建等技术。
由于液滴微流控单细胞微反应器技术属于高度交叉学科，需要生物学、微流体、光学、电学、软件控制等多个学科的融合，因此研发难度较高，为此，2014年受导师派遣，他在上海交大-密歇根大学联合研发项目的支持下，来到密歇根大学安娜堡分校机械工程学院开展联合培养。在Katsuo Kurabayashi教授的指导下，与钟孟庭博士（现任职于台湾中央研究院）展开密切合作，历时一年半，攻克了芯片、流体、检测、分选等技术难关，终于搭建起完整的双荧光通道液滴微流控超高通筛选平台（图2）。2015年他回国并将这一技术平台引进到上海交通大学，在此基础上，开展了布洛芬酯酶的立体选择性进化，获得了具有药物合成应用潜力的高效突变体，该工作打破了FADS系统只适用于对酶活性、表达量等简单性能进行筛选的局限，率先应用于酶立体选择性等同时涉及两种底物的复杂性能的筛选，在酶工程领域获得了广泛关注。
图2. 双通道单细胞筛选技术体系芯片实物图及工作照片
2019年，博士后出站，马富强进入中科院苏州医工所工作，并在新的工作岗位将液滴微流控技术进一步发扬光大。在苏州医工所的大力支持下，建立了医药酶工程研究中心，搭建起一系列的FADS筛选设备，并与苏州医工所王策研究员团队就流式细胞仪研发达成合作，研制出通量更高、操作更简便的无鞘液流式微滴超高通量筛选仪，适用于不同类型酶的筛选，并开展了广泛应用。十多年来，他一直专注于液滴微流控超高通量筛选技术的发展和应用，在国内外酶工程领域都占据了一席之地，尤其是他们建立的荧光微液滴捕获技术（FDE）[Analytical Chemistry, 2016, 88(17):8587-8595.]、通用型荧光偶联策略[Biotechnology Advances, 2023: 108173.]、双荧光通道单细胞筛选体系（DMDS）[Nature Communications 2018, 9:1030]等，在国际上处于领先地位。
2、持续开发单细胞微反应器荧光偶联策略
将目标酶的性能与荧光信号偶连起来是进行FADS筛选的前体，但绝大多数酶的催化反应都不产生荧光信号，这大大限制了FADS技术的应用。为拓展FADS技术的应用范围，马富强团队一直致力于探索设计针对不同酶、且具有通用性的荧光偶联策略，先后开发了多种荧光偶联策略，包括适用水解酶的荧光底物设计策略，适用于转氨酶、氧化酶的酶联荧光偶联策略、基于生物传感器的荧光偶联策略等。团队中江晶洁博士近期对现有报道的FADS荧光偶联策略进行了系统的梳理和介绍，并列举了FADS技术在酶、代谢产物及抗体筛选中的应用案例，为FADS技术的应用拓展提供了指导[Biotechnology Advances, 2023: 108173.]。
图3. FADS技术的工作流程及目前开发的荧光偶联策略
3、仪器商品化
由于FADS系统的技术复杂性，使得常规实验室很难自主搭建，因而限制了该技术的普遍应用，也不利于该技术的进一步升级优化，因此他们从一开始就注重该技术的商业化，使之可以被更多的人应用。
2017年，清华大学邢新会教授到交大交流考察，看到这一套设备十分赞赏，随即引荐天木生物展开技术对接，将该体系开发成商品化设备。在马富强研究员的指导下，天木生物历时2年多，攻克了一个又一个工程化难点，从原理机到工程样机，最终成功推出商品机，并正式命名为液滴微流控单细胞分选仪（Droplet-encapsulating microfluidic cell-sorter, DREMcell）。该设备在保持原理机超高通量、超低试剂消耗、可对细胞裂解物和外泌物进行筛选的核心性能的基础上，还具有集成化高、操作方便、稳定性好、支持多通道荧光检测及筛选等优点（图4）。在酶工程、合成生物学、抗体筛选等领域都具有巨大应用潜力，得到了学术界和产业界的高度关注，截止到2023年6月份，该设备的意向客户已发展到几十家。
图4. 液滴微流控单细胞分选仪Droplet-encapsulating microfluidic cell-sorter (DREMcell)从原理机到商品机的研发历程（左），以及商品机的工作场景照片（右）
4、医药酶工程应用及展望
历经12载，经历了原理机-原型机-商品机的迭代升级，也经历了技术细节的不断创新打磨，在此过程中，马富强研究员利用FADS技术成功开展了一系列应用。例如，将FADS用于布洛芬酯酶的立体选择性改造，经过五轮的突变和筛选，最优突变体对S-布洛芬底物的选择性提升了700倍（图5），有潜力用于光学纯S-布洛芬药物的手性拆分[Nature Communications 2018, 9:1030]；还利用FADS技术从宏基因组中筛选新酶基因，有助于从自然界丰富的基因组资源中快速挖掘序列和功能全新的新酶资源[Environmental Microbiology 2021, 23(2), 996-1008.]；近年来，马富强团队还与浙江大学邹宏斌教授密切合作，将FADS用于关键医药中间体合成酶，如转氨酶的改造，以绿色制备一系列高值手性胺药物；此外，他们与威海先进医用材料与高端医疗器械山东省实验室合作，将FADS用于各种生化诊断、分子诊断核心原料酶的研发，为解决我国诊断核心原料酶长期以来被国外原料巨头垄断的“卡脖子”困境提供了源动力。
由于FADS技术在酶研发领域的重要价值，马富强团队先后获得一系列国家重点研发计划、江苏省双创人才、山东省实验室项目等国家级、省部级及企业项目的支持，累计经费达4000余万元。随着更多新的荧光偶联方法的建立，FADS应用范围将越来越广，几乎涵盖了六大类酶。百尺竿头更进一步，目前他们正与中科院苏州医工所流式细胞仪团队密切合作，开发多荧光通道、通量更高、操作更便捷的超高通量筛选技术，继续为酶分子改造提供强有力的筛选工具。
图5. 利用FADS对布洛芬酯酶进行立体选择性进化。经过5论突变筛选，获得对具有药效作用的S型对映体选择性提升700倍的突变体，有潜力用于光学纯布洛芬药物的手性拆分。
5、结语和致谢
自从上世纪90年代定向进化技术问世以来，极大提升了人们对蛋白质的改造能力，能够更加自如地扮演造物者的角色，能够随心所欲地对酶进行改造，而FADS技术则是为定向进化插上了一对翅膀，极大加速了定向进化进程，使得人们有能力在更短时间内完成分子改造。回想十几年前在上海交大实验室里苦苦探索的那些日日夜夜，到现在在苏州医工所建成医药酶工程研究中心，凝聚了十多名专业医药酶研发人员的团队，不禁感慨，未来的酶工程领域将越来越多用到FADS超高通量筛选技术，路漫漫其修远兮，马富强团队将继续坚定地将FADS发扬光大，为酶工程贡献科研工作者的绵薄之力，造福于人类社会。
最后，马富强研究员在本刊真诚感谢导师冯雁教授和杨广宇教授，没有他们当初在科研方向上高屋建瓴的布局就没有上述成果，没有他们一如既往的支持和鼓励FADS技术也难以获得长足发展；感谢天木生物的合作者，他们在商品机研制中的卓越贡献，也使得该技术能够服务更广大的科研人员，进而为该技术的持续改进优化提供不竭动力；更要感谢苏州医工所提供的良好科研条件，感谢所领导一如既往的大力支持，为他们团队提供了广阔的成长舞台！
专家简介
马富强，中国科学院苏州医工所研究员。2016年博士毕业于上海交通大学，博士期间赴美国密歇根大学进行联合培养。主要从事医药酶学及分子诊断研究，在酶分子改造、酶超高通量筛选、酶结构-功能关系解析、分子诊断酶研发及工业化、分子诊断新方法及试剂研发等方向开展了一系列工作。代表性成果包括：1）建立了先进的双通道液滴微流控超高通量筛选体系；2）发明了荧光液滴捕获（Fluorescence droplet entrapment，FDE）酶底物设计策略，使超高通量筛选体系的应用范围扩展至多种重要酶类；3）实现了布洛芬酯酶、转氨酶等多种重要酶分子的快速定向进化分子改造；4）建立了从核心原料酶到试剂再到配套设备的分子POCT一体化解决方案。近年来在Nature Communications、Biotechnology Advances、Science Advances、Analytical Chemistry 等国际顶级期刊发表论文20多篇，申请发明专利20余项（202111180303.2，202011250781.1，：202011624067.4）。主持多项国家级、省部级项目，累计获得经费支持4000余万元。先后获得中国科学院“青年创新促进会”会员、江苏省“双创人才”计划等人才称号。
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