STED超分辨显微镜

作者：时间：2019-01-08

光学超分辨显微术的成像分辨率超越了光学衍射限制，其成像分辨率远高于传统的光学显微镜，是近年来的研究热点，出现了多种类型。受激辐射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）显微术是首先提出也是直接克服光学衍射极限的远场光学显微术，其建立在激光共聚焦显微成像基础上，相对于其它类型的超分辨显微术，成像速度相对较快，能够对活细胞进行成像，在生物医学研究中可以探测更精细的结构。

STED超分辨成像技术建立在共聚焦显微成像技术基础上。下图是典型STED系统构成原理，一束激发光(绿色所示)通过物镜在焦平面处形成近似艾利分布的点扩散函数(截面1所示，该点扩散函数受衍射限制，如果直接用于成像就是典型的共聚焦成像)，另外一束损耗光(STED，红色所示)通过相位板后再聚焦形成中空的圆环形点扩散函数(截面2所示)。两种点扩散函数空间重叠，使得有效激发区域被大大缩小(截面3所示)。有效荧光激发区域产生的荧光被探测器记录，在控制系统的控制下，通过逐点、逐层扫描，经过图像处理后得到样品的三维荧光图像。可以看出，除了系统中增加了一路损耗光以外，STED的构成与共聚焦显微成像完全一致，包括信号的探测和处理，以及三维扫描的方式也相同，因此可以以共聚焦显微成像系统为平台，研发STED显微镜。

图1 STED系统构成原理

中科院苏州医工所推出分辨率达50nm的STED超分辨显微镜样机，采用超连续谱皮秒脉冲光源，分出两路光，一路作为激发光（488nm），另一路作为损耗光（592nm）；在损耗光光路中设置一个0-2π的涡旋相位板在物镜焦点处形成一个中央光强为零的面包圈形的损耗光斑；激发光在物镜焦点处形成一个高斯分布的激发光斑；采用单光子计数器进行荧光探测。激发光波长和损耗光波长可根据需要进行定制。目前已发表论文8篇，其中SCI收录4篇，EI收录3篇；已申请专利17项，其中发明专利13项，实用新型专利4项。