免疫荧光技术

　　你是否在文献里看到五颜六色的细胞？ 

　　你是否好奇细胞怎么会有那么多颜色？ 

　　你是否好奇如何得到高分辨率的照片？ 

　　科研工作者是如何做到的呢？他们主要是通过免疫荧光技术对细胞或组织进行染色，再利用荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜拍摄获得高清照片。 

　　在细胞生物学研究中，我们经常需要对细胞的某个结构或者其中的某个分子进行特定研究，因此我们通过利用各种各样的“Marker”对我们要研究的特定结构或分子进行特异性标记或染色从而方便我们去观察其形态或者含量等指标。免疫荧光技术就属于其中的一类。免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 

　　免疫荧光是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。 

　　直接法是指将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，而间接法是指先用已知未标记的特异抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体与其反应，形成抗原-抗体-抗体复合物。另外还有补体法是指利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光。 

　　免疫荧光技术的基本步骤如下： 

　　在操作过程中，每一步操作都很重要并且会影响实验结果，细胞片制备是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，因为一旦发生细胞掉片，后续都难以进行，这一步关键的是玻片的处理以及细胞的活力。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其他方法（如E或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此在该过程中，需要避光操作，另外抗体浓度的选择也很关键，最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像免疫印迹（Western）那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，并结合自己的实验方案以及实验结果进行每一步细节的优化，才能得到更完美的实验结果  blot20℃LISA

　　随着近些年技术的不断完善，免疫荧光技术目前在细胞生物学研究中有着广泛的应用，它可以用于检测细胞中特定分子或特定结构的定位，并且可以通过荧光强度等指标对其进行定量分析。荧光标记也不再局限于单一标记，目前可以进行荧光双标甚至更多标记，从而在控制实验变量的情况下能同时观察研究多个特定生物大分子，更加方便实验的进行。 

　　这里为大家展示我们所拍摄到的细胞分裂过程中的部分图片。图片仅做展示，不包含实验处理，不作为实验结果。（注：本文中免疫荧光图片由高山课题组杨镇宇同学提供。）