对血液、体液、细胞中的DNA分子信息进行检测，可以预知和判断身体患病的风险，既可以用于疾病的诊断，也可以用于风险的预防。有很多检测方法用于这些生物标记物的检测,但是这些检测方法都有一定的弊端。因此，一种快速，易操作，低成本，超灵敏的检测平台对疾病的早期诊断和精准医疗具有非常重要的意义。
目前已有的dna检测方法主要分为三类：第一类利用杂交的原理，第二类利用扩增技术，第三类是直接测序的技术现已更新到第三代，这些方法都有一定的局限性
因此，我们采用了一种基于DNAWalker 的新检测技术。DNAWalker，就是 DNA步行器，一种以DNA分子为构筑元件的分子机器。优势在于有强大的序列可编程性和精确的分子识别能力。这是一种通过目标物触发的walking行为扩大检测信号，从而实现灵敏的检测平台。通俗来说就是以低浓度的目标序列为驱动力，一步一步像行走一样的方式逐步将所设计的DNA探针以不同的方式暴露出标记的信号分子。
基于这一理念，我们发展了一种基于双足DNA步行器的电化学核酸传感器。其中涉及三重信号放大，包括磁性富集、链置换放大及核酶介导的DNA步行。详细的原理如示意图1所示。首先合成了Fe3O4@Au复合磁性纳米颗粒，并将DNA探针A固定于其表面，由于磁性纳米材料的巨大比表面积，可以实现较高密度的探针A的负载，可用于在磁性分离后从待测样品中富集靶DNA。此外，可以在Fe3O4 @ AuNPs的表面上进行链置换扩增。在聚合酶和切口核酸内切酶的存在下，靶标诱导的再循环DNA聚合，发生切口和链置换反应;同时，产生大量DNA序列（探针B）并释放用于随后的DNA步行。与传统的DNA步行器不同，本项目提出的DNA步进装置由探针A修饰的Fe3O4 @ AuNPs，用于链置换扩增的聚合酶/切刻核酸内切酶，四面体DNA（TDNA）支持的轨道和两个邻近探针作为双足DNA步行序列组成。首先，在金电极上修饰的TDNA纳米结构支架不仅提高了支持的DNA轨道的分子识别效率，而且避免了使用用于电极表面调制的间隔分子。利用DNA轨道的5'标记的氨基，银纳米颗粒（AgNPs）可以通过银和氨基氮之间形成的化学键定位在电极的界面上。基于高度特征化的固态Ag / AgCl反应，AgNPs可以提供半峰宽极窄的溶出电流峰，适合用作优异的电化学信号源。其次，两个邻近探针（探针C和D）设计为两个步行器，其含有相同的金属离子依赖性核酶序列。虽然它们与TDNA顶部的DNA轨道互补，但是单个探针C或D不能与DNA轨道结合。然而，通过靶DNA诱导的链置换扩增产生的探针B能够帮助形成DNA星形三角形纳米结构，并且使探针C和D的尾部序列紧密接近。因此，DNA星形三角形纳米结构和DNA轨道的解链温度增加。在有效退火后，DNAzyme在Pb2 +存在下切割DNA轨道，导致用氨基去除单链DNA区段。同时，单个解离的DNA步行器（探针C或D）可以与相邻的完整底物结合并进行进一步步行过程。通过DNA步行切割氨基使得AgNPs作为电化学纳米探针的吸附失效。因此，通过分析电化学信号，通过三重信号放大实现靶DNA的超灵敏定量分析。
图1. 基于双足DNA步行器的DNA传感器示意图
为了探索本传感策略的定量准确性，我们研究了生物传感器的线性扫描伏安(LSV)性能，以在最佳条件下检测不同量的靶DNA。如图1A所示，随着靶DNA的增加，产生更多的探针B分子用于形成双足DNA步行者。因此，留下较少的氨基以吸收AgNP，并且LSV峰逐渐下降。 DNA浓度的对数与峰值电流的变化之间的详细关系如图1B所示。良好的线性范围为1 fM至100 fM，回归方程如下：
y = 21.560 + 326.224 x (R2 = 0.996, n = 4)
其中y代表降低的峰值电流，x是DNA浓度的对数。检测限（LOD）计算为0.22fM。
图2 （A）用于检测DNA的线性扫描伏安图（B）线性扫描伏安图峰值电流变化与靶DNA的对数浓度的校准曲线。插图显示从1 fM到100 fM的线性范围。
总之，本研究项目开发了一种超灵敏的电化学生物传感器，将双足DNA步行器和链置换扩增结合在磁性纳米材料上。该传感策略为临床诊断目的提供了检测痕量DNA的潜在工具。此外，它还可以通过将分子识别元件改变为某些DNA探针来扩展用于分析蛋白质和细胞等各种目标。
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