分子诊断用酶是核酸检测体系的核心催化元件，可以高特异性的催化核酸生化反应，在核酸扩增、基因测序与基因突变检测等关键环节不可或缺，是保障分子诊断实现高灵敏度与高特异性的核心基础。其中，单分子酶是单分子长读长荧光测序的核心催化引擎，对长片段核酸测序解析至关重要；但是，该类型酶需在高强度激光环境中长期持续工作，工作光强往往超出酶自身天然耐受阈值，因此酶的抗激光损伤能力已成为制约超长读长荧光测序性能提升的关键瓶颈。
酶活表征多采用宏观群体平均检测模式，该方法会抹平不同酶单体固有的功能异质性，难以精准量化单分子个体差异。而现有已建立的单分子表征技术普遍存在检测通量偏低、评价参数单一静态、难以长时间原位动态追踪等短板，无法满足长时程、高通量的单分子酶活动态定量分析需求。
图1.AI辅助数字化单分子活性追踪平台
针对这一关键瓶颈，团队创新开发了“AI辅助数字化单分子酶活性追踪平台（dSMAT）”。利用微米孔限域隔离单个DNA聚合酶滚环扩增反应，结合自研 U-Net 算法，校正漂移并精准提取降噪，基于对数千个单分子酶扩增动力学荧光斜率的15 小时长效监测，定量表征酶催化速率、内在异质性与合成稳定性等关键功能特征参数。
图2.dSMAT-AI——基于深度学习的ROI提取方法
基于该dSMRT平台的单分子多参数定量检测，研究团队解耦了DNA聚合酶的内在异质性与光氧化损伤，并提出了酶的氧化瘢痕机制。研究发现在高光子通量下，反应体系产生活性氧并氧化酶的敏感氨基酸残基，使其展现出动力学受损的异质性展宽状态，这一状态可通过抗氧化缓冲体系协同得到改善。该创新工作突破传统酶学表征方法局限，在单分子尺度上为酶的精准评估与优化提供技术支撑。
图3.单分子phi29 DNA聚合酶中激光诱导氧化瘢痕化及动力学异质性变化
此次在单分子酶活性追踪方面取得的技术突破，基于课题组在高通量实时数字核酸检测方法和诊断仪器的持续技术探索。前期工作中，提出了“荧光动态调控（FIRM）联合内在聚类”分析方法，纠正了微单元内的非均匀扩增缺陷，显著提升了扩增效率与曲线区分度（Anal. Chem. 2025, 97, 15085）。创新开发了自校准动态图像复原模型（SAPAR），实现了系统在长程受热下焦点信号的智能动态修复重构（Anal. Chem. 2025, 97, 25304）。利用此时空信息提取与重构优势，进一步系统构建了区域时空立方体去噪技术（STCDM），以抑制并滤除高频时空检测过程中的信号联锁波动干扰（Anal. Chem. 2025, 97, 9049）。这些工作构筑了核酸高准确智能识别与高灵敏检测技术体系，助力团队实现从临床分子诊断仪器迈向单分子酶微观性能解析的跨领域攻关。
图4.在实时数字多重核酸检测分析研究中的研究基础
本研究成果以题为“AI-assisted digital single-molecule activity tracker for decoupling intrinsic heterogeneity from photo-oxidative damage in high-photon-flux enzymology”的论文发表在期刊《Advanced Science》（中国科学院一区，TOP，IF：14.1）上。苏州医工所为第一完成单位，苏州医工所博士后郑安然、工程师杨弃为共同一作，苏州医工所周连群研究员、张威研究员为共同通讯作者。该研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、江苏省前沿技术研发计划、苏州市科技计划等项目的资助。
文章链接：http://doi.org/10.1002/advs.76238
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