端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，包含催化DNA延伸的内源性RNA模板，在大多数人类癌症中表达上调，是一种重要的肿瘤标志物。另一方面，特定微小核糖核酸（miRNA）的异常表达也与癌症的发生发展密切有关。因此，端粒酶与miRNA的联合检测分析在临床诊断、生物医学研究和抗癌药物筛选等方面具有重要的研究价值。目前，常规检测方法这两类分子的方法主要是端粒重复序列扩增技术(telomerase repeat amplification protocol, TRAP)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。然而，这两种技术很难进行直接的整合。实现端粒酶与miRNA同步高灵敏分析仍然存在很大的挑战。
近期，苏州医工所缪鹏研究员课题组发展了一种基于银纳米簇(silver nanoclusters, AgNCs)的荧光逻辑门体系，用于同时检测端粒酶与miRNA。其检测原理如图1所示，首先设计用于杂交链式反应的发夹结构DNA探针H1和H2。H1用于捕获触发链和打开H2的发夹结构。由于H2的3’端含有合成AgNCs的模板序列，可以通过引入Ag+与特定还原剂来原位合成AgNCs，利用其发射的明亮荧光作为输出信号。初始状态下，H2-AgNCs吸附于氧化石墨烯表面，其荧光处于淬灭状态。另一方面，H0OR和H0AND序列分别参与“或”门和“与”门的逻辑运算。它们的序列中都包含可以触发H1和H2之间杂交链式反应的序列。当端粒酶与miRNA作为信号输入引发相应逻辑门的反应后，能够起始杂交链式反应。该反应形成的长双链产物可以从氧化石墨烯表面释放出来，利用AgNCs恢复的荧光作为输出信号来指示目标输入的信息。
图1. 基于AgNCs和杂交链式反应的荧光逻辑门检测miRNA和端粒酶示意图
通过定量分析，miRNA和端粒酶的检测限分别为2.8 pM和2 cells。“或”门能够在两种输入分子任意存在的情况下得到明亮的荧光信号输出。“与”门只有在miRNA和端粒酶共同存在的情况下才能够输出较强的荧光信号。在本工作中，氧化石墨烯不仅作为荧光淬灭剂，我们也可以利用其将荧光逻辑门体系转运至细胞内，来观察细胞内端粒酶与特定miRNA的表达情况（图2）。本工作中发展的荧光逻辑门具有成本低、操作简单、灵敏度高、选择性高等优点，实现了对两种肿瘤标志物的同时检测，能够可以有效提高相关疾病的诊断准确性。
本工作得到了国家重点研发计划(2017YFE0132300)等项目的资助，结果已发表Nanoscale, 2022, 14, 612–616 (IF=7.79)
论文链接: https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/NR/D1NR05622K
图2. HeLa细胞在连续添加氧化石墨烯@AgNCs、辅助链和端粒酶抑制剂后的逻辑门共聚焦图像
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